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脑胶质瘤靶向药物递送系统组织结构

  血脑屏障及血瘤屏障的存在,严重阻碍了化疗药物进入脑胶质瘤组织中发挥抗癌药效。但近年来,随着对肿瘤认知的深入以及实验手段的发展,越来越多的脑胶质瘤靶向glioma targeting药物递送系统drug delivery system已经建立,用于提高肿瘤杀伤效果。基于脑胶质瘤微、脑胶质瘤脉管系统等的生理、病理特征,具有不同脑胶质瘤靶向策略的药物递送系统,如一级靶向、二级靶向及双靶向等,包括肿瘤微响应靶向在内的其他药物递送系统。脑胶质瘤是颅内常见的发生于神经外胚层的恶性肿瘤,来源于星型细胞或少突胶质细胞,占颅内肿瘤的35. 26% ~ 60. 9%。根据肿瘤细胞的类型可分为星形细胞瘤、少突胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。而按世界卫生组织( WHO) 分级标准,依据肿瘤细胞具有多形性、核多见、血管增生和坏死四个特征,又可将其分为4级,其中Ⅰ、Ⅱ级为低级别胶质瘤,患者平均存活时间为3 ~ 5 年; Ⅲ、Ⅳ级为高级别胶质瘤,患者平均存活时间为1 ~ 2 年。由于脑胶质瘤对脑组织具有很强的性,手术治疗效果较差,且预后不佳。有资料表明,即使99. 999%的肿瘤细胞被手术切除,的0. 001%也会迅速增殖,且增殖周期仅为3 ~ 7 d。因而,术后的放化疗策略对于脑胶质瘤的治疗具有非常重要的意义。但是,由于脑胶质瘤相较于其他部位实体瘤渗透增强和滞留( enhanced permeabilityand retention,EPR) 效应较弱及血脑屏障( bloodbrain barrier,BBB) 的存在,即成为血瘤屏障tumor barrier。普通的化疗方式很难使药物进入肿瘤组织从而起到杀伤肿瘤细胞的作用。为了克服这样的缺点,目前广泛采用药物递送系统通过被动靶向与主动靶向将药物有效地蓄积于肿瘤组织,从而提高疗效,降低毒副作用。

  脑胶质瘤具有两个突出的组织病理学特征,即BBB 和血瘤屏障( blood-brain tumor barrier,BTB) 。一方面BBB 了98% 以上的小及100% 的大药物渗透入脑,但同时BBB 的物质转运机制可以脑内营养物质的需求,如跨细胞膜通道转运和细胞旁通道转运,这种生理条件下的物质交换机制,也为脑肿瘤靶向药物递送系统的设计提供了必要的理论依据。此外,随着脑胶质瘤的病情进展,新生血管不断生成,原有的脑毛细血管也被整合到肿瘤内部,由此形成了BTB,虽然这部分血管壁上具有一定的孔径,但其保留了BBB 的部分功能,因此对脑肿瘤靶向纳米药物递送系统的设计提出了挑战。

  众所周知,BBB 是介于血液和脑组织之间的对物质通过有选择性阻碍作用的动态界面,由脑的连续性毛细血管内皮及其细胞间的紧密连接、完整的基膜、周细胞及星形胶质细胞脚板围成的神经胶质膜构成。其能够控制血浆中各种溶质选择性的通透,把有害物质拒之脑组织之外,使其不能逸出脑毛细血管,从而保持脑组织内的基本稳定。因此,对于脑组织或BBB 而言,任何一种药物均可被认为是侵害脑组织的异物,将其“拒之门外”,这就很大程度上阻碍了化疗药物进入脑部肿瘤组织,进而发挥疗效。另外,就目前的临床现状,BBB 的存在不仅阻碍了脑肿瘤的治疗,也对其诊断具有一定的消极作用。例如采用磁共振显像技术进行脑胶质瘤的诊断,其阴性率往往较高,尤其是对于低级别的脑胶质瘤,BBB 的存在阻碍了造影剂进入肿瘤区域,不能对其有效成像。因此,BBB 作为脑部肿瘤的层使得脑肿瘤的治疗更具挑战性,同时,也成为了治疗策略必须克服的关键所在。尽管BBB 严格控制着脑组织和血液的物质交换,但在生理条件下也具有脑内营养物质平衡的能力。在积极摄取脑细胞所需营养物质的同时,排泄出代谢产物和不能利用的物质。而这种生理条件下的物质交换过程,也为脑胶质瘤靶向药物递送系统的设计提供了必要的理论依据。目前认为,BBB 的生理结构使得其具有特殊的转运机制,主要包括跨细胞膜通道转运和细胞旁通道转运。跨细胞膜通道转运按物质流向分类,主要包括从血液到脑的脑内摄取、进入脑内的外源性化合物从脑内向血液的外排以及从脑间质液向血液的外排。而其中与化疗药物递送系统密切相关的,则是如何促进药物由血液入脑。目前主要有以下几种方式: ①载体蛋白参与的脑内摄取。这种机制对于多种小化合物的脑内递送极为重要,通常将小药物的结构设计为可被BBB 上表达的载体蛋白摄取,但又不被外排载体蛋白所识别。已知的相关载体蛋白较多,主要包括葡萄糖转运体1 ( glucosetransporter 1,GLUT1) 介导的脑内己糖转运体、L 型氨基酸转运载体1( L-type amino acid transporter 1,LAT1) 介导的中性氨基酸转运体、胆碱转运体、维生素转运体等。②受体参与的脑内摄取。这种方式是依赖于脑毛细血管内皮上表达的受体对配体的性识别、结合并介导其穿过细胞进入脑部的过程,具体说来,受体与配体性识别后,细胞膜内陷形成内化转运小泡,从而引发细胞的内化,转运小泡服从细胞本身对其的导向转运,在跨细胞过程中,含有受体-配体结合物的小泡被输送到极性内皮细胞膜的基底侧,然后被到细胞外。借助这条途径,配体可跨越内皮细胞,进入脑内而不经过降解。脑内摄取离子、胰岛素和瘦素均是通过此途径而作用的。③吸附作用参与的脑内摄取。这种方式主要是通过带阳离子的和细胞膜表面的负电荷通过静电力相结合而发挥作用的。该法由于缺乏性,可能造成其他组织的广泛摄取增加而不被认为是药物递送系统设计的关键所在。④蛋白转导域参与的脑内摄取。这种作用的典型代表为与人免疫缺陷病毒( human immunodeficiency virus,HIV) 相关的激活因子( tranion activator,TAT) ,但同吸附作用类似,缺乏靶向性。细胞旁通道转运由内皮细胞骨架收缩力、细胞间紧密连接和细胞外基质控制的,细胞结构的动态变化控制旁通道的和关闭,所以,具有与跨细胞膜转运大不相同的生理特征,旁转运大多是被动进行的,与电化学、流体力学和渗透压梯度有关,因此,具有较高的传送效率但较低的选择性,另外,该转运方式没有转运方向选择性,血液向脑组织以及脑组织向血液的转运同时存在。目前,常采取的策略是通过旁转运BBB,从而使BBB 稳态短时失衡、,从而使药物入脑。但采用此法时务必尽可能将部位在BBB 周围、时间尽可能缩短、的尺度尽可能控制在恰好能够使药物通过的孔径。临床上已有通过此方法介导药物入脑的案例,如动脉内注射高渗溶液甘露醇,治疗胶质瘤、神经外胚层瘤等; 又如缓激肽和其类似物也被用于BBB 而治疗胶质瘤等。由此可见,BBB 既是药物入脑的阻力,同时其具有的物质转运机制也可以作为脑肿瘤性靶向药物递送系统的设计依据。

  血管形成是维持肿瘤生长的必要条件,在脑胶质瘤中,尤其是高度恶性的胶质瘤往往富含血管并呈浸润性生长。脑胶质瘤内的血管生成由两方面构成: 一是肿瘤细胞沿脑组织正常血管生长使之整合入肿瘤实质; 二是血管形成因子新生血管产生。这些来源不同,但结构功能类似的微血管结构,构成了脑部肿瘤组织的BTB。胶质瘤血管微的结构特征是由肿瘤和局部宿主自身因素共同决定的。因此,与正常脑毛细血管相比肿瘤血管的内皮细胞,周细胞和基底膜明显异常。BTB 的结构具有以下特点: ①内皮细胞增殖,胞内吞饮囊泡增多,相当一部分相互融合; ②内皮细胞间紧密连接异常短且密集,部分增宽、; ③周细胞增多,变大; ④毛细血管基膜呈局限性或广泛性增厚,基板多层化,胶原纤维增生,且不连续,周围间隙增宽; ⑤缺乏星形细胞突起形成的毛细血管基底膜鞘。所有这些肿瘤微血管组织的解剖结构特点,使得肿瘤实质的BTB 具有明显异质性、通透性,且在恶性肿瘤的中心通常通透性更高,而那些增殖活跃、浸润边缘的瘤周脑组织也表现出BBB 完整性不同程度的缺陷。除此之外,胶质瘤细胞也分泌一些可溶性因子引起BBB ,这些因子的确切种类尚不清楚,目前已知的包括蛋白激酶类如基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinase,MMP) 、血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF) 和分散因子/肝细胞生长因子( scatter factor /hepatocytegrowth factor,SF /HGF) 。尤其是VEGF 在脑肿瘤中表达显著升高,在肿瘤血管的内皮细胞上伴有VEGF 受体的表达,而正常脑组织的血管内皮却未见表达,VEGF 与其受体结合刺激血管内皮细胞的增殖并增强血管的通透性。总的说来,BTB 与BBB相比具有较高的通透性,但由于其特殊的生理结构,在一定程度上保留了BBB 的特征。另外,与BTB 这一病理特点相关的脑胶质瘤靶向药物递送系统的设计也涉及另一个概念,即EPR效应———正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整,大和脂质颗粒不易透过血管壁,而实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差,淋巴回流缺失,造成大类物质和脂质颗粒具有选择性高通透性和滞留性,这种现象被称作实体瘤组织的EPR 效应。虽然EPR 效应广泛存在于各种实体瘤组织中,但对于脑胶质瘤,由于其存在部位的特殊性,也使得这种EPR 效应所产生的被动靶向性异于常规。具体说来,脑胶质瘤的生长最初依赖于经由脑毛细血管物质交换所供给的养分,但随着肿瘤的增大,供给的养分已不足以满足肿瘤生长的需求,因此会在脑肿瘤部位衍生出许多新生血管,而这些血管与其他脑部血管具有一定的相似性,血管壁上的孔径往往较小,因此,部分保留了BBB 的特点。这样的情况就了只有小于血管壁上孔径的粒子才可以进入肿瘤组织,进而通过EPR 效应在肿瘤部位蓄积。因此,脑胶质瘤的EPR 效应比其他部位实体瘤的弱,这也成了目前脑胶质瘤治疗的一大瓶颈。

  目前脑胶质瘤的靶向策略可以分为3 种: 依据EPR 效应的被动靶向,依据肿瘤表面性高表达的受体作为药物递送系统作用靶点的一级靶向,以及在一级靶向的基础上增加BBB 靶向的二级靶向。

  与其他部位实体瘤类似,脑胶质瘤组织血管壁间隙大、完整性差、淋巴回流缺失,使得一些物质能够通过EPR 效应直接蓄积于肿瘤部位。理论上,利用这一特点,当设计的药物递送系统粒径小于肿瘤血管壁间隙孔径时,即可在一定程度上实现药物在肿瘤部位的有效蓄积。但由于BBB 以及BTB 的存在,使得这一被动靶向过程的优势并没有凸显出来。每种实体瘤在组织病理、大小、基因型、所处微等方面都有很大的区别,而能够通过EPR 效应实现被动靶向递送化疗药物的脑胶质瘤区域通常具有如下特点: 生长旺盛的肿瘤区域; 血管血流丰富的肿瘤区域。而后者更为重要,即血流量大,由此导致的药物流过肿瘤组织的概率较高。但在脑部组织,一方面,BBB 滤过了大部分的化疗药物,另一方面,通常在脑胶质瘤边缘部位血流丰富,而在深部组织,血流并不非常充足,因此,一定程度降低了化疗药物在

  肿瘤部位的蓄积。还有报道显示,其他部位实体瘤的新生血管内皮间隙在100 nm ~ 2 μm 之间,而脑胶质瘤的间隙孔径仅为100 nm 左右,这又为化疗药物的被动靶向过程增加了难度。目前,由于种种,单纯依靠EPR 效应实现被动靶向胶质瘤的研究较少,但有报道显示,可通过配合Ⅱ型血管紧张素提高机体循环系统血压,从而导致肿瘤部位血流量增大,实现提高EPR 效应的目的; 另外,也有研究显示,通过聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG) 修饰的纳米脂质体以及胶束聚合物可以避免被网状内皮系统,进而提高其血浆半衰期,最大限度地蓄积在肿瘤部位,但是这种修饰同时也会降低肿瘤细胞对药物的摄取。尽管EPR 效应在化疗药物递送至脑胶质瘤方面效果不佳,但是有人却利用脑胶质瘤上多位点的EPR 效应差异进行血氧定量,指导氧气缺乏引起的肿瘤耐药的化疗方案的制定。虽然BBB 与BTB 是脑胶质瘤治疗的两大障碍,但结合其组织病理学特点,目前已研究针对这一药物递送系统的关键靶点,通过设计一级靶向、二级靶向、双靶向等药物递送系统,实现化疗药物的合理分布及有效蓄积。

  随着对脑胶质瘤认识的深入,目前已陆续发现了一些在肿瘤组织存在性表达,明显区别于正常组织的蛋白质类标志物,通常是一些受体,存在于肿瘤细胞、肿瘤组织内新生血管内皮细胞等的表面。依据其设计出的配体,通常以一定的手段连接在药物递送系统上,当药物递送系统运行于体循环时,一方面,可一定程度通过EPR 效应被动地蓄积于肿瘤组织; 另一方面,由于配体靶向头基的存在,可使药物递送系统主动识别脑胶质瘤,并被肿瘤细胞摄取,而发挥药效。当修饰的配体头基仅能够识别某种膜表面受体时,这种靶向策略常被认为是一级靶向,常见的可作为一级靶向受体的蛋白主要包括表皮生长因子受体( epidermal growth factor receptor,EGFR) 、MMP-2、整合素类、白细胞介素( interleukin,IL) 13 受体等,具体分述如下。

  MMP-2 MMP 是一个大家族,具有降解或分解细胞外基质的作用,因其需要Ca2 +、Zn2 + 等金属离子作为辅助因子而得名。其家族都具有相似的结构,一般由5 个功能不同的结构域组成:①疏水信号肽序列; ②前肽区,主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后,MMP 酶原被激活; ③催化活性区,有锌离子结合位点,对酶催化作用的发挥至关重要; ④富含脯氨酸的铰链区; ⑤羧基端区,与酶的底物性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMP 在上述结构的基础上各有特点。各种MMP 间具有一定的底物性,但不是绝对的。同一种MMP 可降解多种细胞外基质成分,而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP 降解,但不同酶的降解效率可不同。根据MMP 作用底物、结构可分为6 组: ①胶原酶( MMP-1、MMP-8、MMP-13) ; ②明胶酶: 明胶酶A( MMP-2) 和明胶酶B ( MMP-9) ; ③间质溶解素( MMP-3、MMP-7、MMP-10) ; ④膜型基质金属蛋白酶( MT-MMP: MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25; ⑤基质溶解酶( MMP-7、MMP-26) ; ⑥剩余的MMP 不属于前几类,暂归于其他MMP。MMP-2 基因位于人类染色体16q21,由13 个外显子和12 个内含子所组成,结构基因总长度为27kb,与其他金属蛋白酶不同,MMP-2 基因5 旁侧序列促进子区域含有2 个GC 盒而不是TATA 盒。作为在胶质瘤细胞表面普遍高度表达的内肽酶,MMP-2 具有降解弹性蛋白、明胶以及标记Ⅳ、Ⅶ和Ⅹ型胶原中的螺旋区域的作用。且活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位,估计其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中起“钻头”的作用。有研究表明,细胞间基质这些蛋白的降解对于脑胶质瘤的转移具有非常重要的作用,且大量的MMP-2 蛋白表达及mRNA 的定量实验以及酶分布的考察结果显示,MMP-2 在脑胶质瘤中确实存在过表达的现象,明显高于正常组织的表达量。MMP-2 这种性的高表达即可作为脑胶质

  瘤靶向药物递送系统建立的关键。目前已有不少研究者利用其作为肿瘤靶向靶点。氯代毒素( chlorotoxin,CTX) 是一段从蝎毒里提取出来的具有36 个氨基酸残基的多肽,与MMP-2 具有非常高的亲和力。体外免疫组化结果显示CTX 能够性、选择性地结合于脑胶质瘤细胞,且体内放射标记CTX 示踪结果也显示CTX 能够结合于原位胶质瘤移植的免疫缺陷型裸鼠的肿瘤部位。而一份关于200 例脑胶质瘤患者的病理切片报告也表明,CTX在不同恶性程度的脑胶质瘤上均有高表达,但在患者正常脑组织无分布。另外,又有间接表明,CTX 能够降低MMP-2 的酶活力,且降低脑胶质瘤表面MMP-2 的表达,而对于MMP-1、MMP-3 以及MMP-9 均无影响。CTX 与MMP-2 之间的高亲和性以及MMP-2 在脑胶质瘤上的过表达,使得CTX成为了一种非常有价值的药物递送系统中的配体靶头,目前有研究选用CTX 来构建基因递送系统来靶向脑胶质瘤,将CTX 通过PEG 修饰到聚酰胺-胺型树枝状高材料( PAMAM) ,并包载Trail 治疗基因,来治疗脑胶质瘤,体内外实验均得到较好结果。由于其优异的胶质瘤靶向性,CTX 还被修饰或纳米探针,应用于脑胶质瘤的磁共振显像,如将CTX 与其他小如131 I、Cy5. 5、三氧化二铁纳米粒共价结合,制备成不同种类的探针,再通过γ射线、单光子发射计算机断层成像术( single-photonemission computed tomography,SPECT) 、核磁共振成像( magnetic resonance imaging,MRI) 等成像手段来判断肿瘤的部位、大小、级别等。

  EGFR EGFR 是原癌基因C-erbB-1( HER1)的表达产物,相对质量为1. 7 × 105。EGFR 家族包括HER1( erbB1,EGFR) 、HER2( erbB2,NEU) 、HER3( erbB3) 及HER4( erbB4) 四个,均定位于细胞膜上。erbB-1 广泛分布于除血管组织外的上皮细胞膜上; erbB-2 在正体腔上皮、腺上皮及胚胎中均有普遍的微弱表达; erbB-3 在除造血系统外的多数部位有表达; erbB-4 在除肾小球及周围神经外的所有成年组织均可检测到其表达。EGFR本身具有酪氨酶激酶活性,一旦与EGF 结合可启动细胞核内的有关基因,从而促进细胞增殖。

  研究表明,EGFR 在许多实体肿瘤中存在高表达或异常表达。EGFR 与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤、转移及细胞凋亡的有关。其可能机制包括: EGFR 的高表达引起下游信号转导的增强; 突变型EGFR 受体或配体表达增加可导致EGFR的持续活化; 自分泌环的作用增强; 受体下调机制的; 异常信号转导通的激活等。EGFR 的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用,胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌等肿瘤组织中都有EGFR 的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR 的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR 表达水平的调节异常也存在于翻译过程中及翻译后。以EGFR 为靶标设计抗肿瘤药物的相关研究已越来越多,目前,美国FDA 批准认证的具有EGFR靶向的抗肿瘤药物主要有5 种,包括3 种小化合物和两种人源的抗EGFR 的单克隆抗体,均已应用于脑胶质瘤的临床治疗分别为: ①吉非替尼,EGFR 激酶剂,治疗非小细胞肺癌; ②厄洛替尼,EGFR 激酶剂,治疗非小细胞肺癌,也可与吉西他滨合用治疗胰腺癌。③拉帕替尼,EGFR/HER-2 双靶向剂,治疗乳腺癌; ④帕尼单抗,人单克隆EGFR 抗体,治疗大肠癌; ⑤西妥昔单抗,人单克隆EGFR 及EGFRvⅢ抗体,治疗头颈部鳞状细胞癌和大肠癌。这些配体仅与EGFR 有较高亲和力,且EGFR 在脑胶质瘤细胞上的过表达,使得这一治疗方案具有较高的可行性。除西妥昔单抗外,针对脑胶质瘤受限于BTB 以及BBB 的特殊病理构造,也设计了相关药物递送系统,如有研究利用西妥昔单抗上的Fc 区域与树枝状聚乙二胺高材料共价结合,包载抗肿瘤药物甲氨蝶呤,以治疗脑胶质瘤; 也有报道将这种以免疫原性机制设计的脂质体材料称为免疫脂质体,同样将抗肿瘤药物通过高材料共价连接于西妥昔单抗,靶向EGFR 高表达的脑胶质瘤,从而起到抗癌作用; 另外,也有研究利用125 I标记了柔红霉素衍生物上的氨基-苯甲基,并将其包裹于EGF 修饰的脂质体中,放射自显影术定位目标细胞后显示放射标记的药物主要集中于细胞核中,并通过与肿瘤细胞DNA 共价结合,引起DNA 双链的,从而导致肿瘤细胞生长。

  整合素整合素是细胞黏附家族的重要之一,主要介导细胞与胞、细胞与胞外基质之间的相互黏附,并介导细胞与胞外基质之间的双向信号转导。整合素是由α〔( 12 ~ 1. 85) × 105〕和β〔( 90 ~ 110) × 104〕两个亚单位形成的异二聚体。迄今已发现18 种α 亚单位和9 种β 亚单位。它们按不同的组合构成20 余种整合素。整合素在体内表达广泛,大多数细胞表面都可表达一种以上的整合素,在多种生命活动中发挥关键作用。例如,由于整合素具有黏附作用,使其成为白细胞游出、血小板凝集、发育过程和创伤愈合中的关键因素。另外,某些细胞只有通过黏附才能使其发生增殖,若通过整合素介导的细胞与胞外基质黏附发生障碍则可导致细胞凋亡。整合素作为细胞表面重要的受体,对肿瘤的、生长、和转移以及凋亡等过程都有非常重要的作用。整合素构象或表达的改变,会引起其与胞外基质配体的亲和力发生变化,进而引起肿瘤细胞的一系列改变,包括肿瘤细胞骨架结构的解体,黏附力降低,导致细胞的恶性,影响肿瘤的生长及发展; 改变肿瘤细胞与细胞间基质的黏附能力,影响其信号传导机制,从而使肿瘤细胞的生物学行为发生改变,增强其转移潜能; 变化的胞外基质浓度,也可影响毛细血管细胞的生长和血管的分化或退化等。而对于脑胶质瘤,整合素也有非常重要的作用。有研究表明,整合素中αvβ3 和αvβ5 两种亚型多表达于脑胶质瘤细胞及其脉管系统中,且其表达程度与脑胶质瘤组织学恶性等级相关。尤其是αvβ3,在恶性脑胶质瘤上表达尤为明显,有病理切片显示,从脑胶质瘤边缘到中心,αvβ3 均有较高水平表达。针对脑胶质瘤细胞及其新生血管内皮细胞中部

  分整合素,包括αvβ3、αvβ5 及α5β1 等的高表达特性,可以针对这样的受体设计以其配体为靶向头基的药物递送系统,从而靶向脑胶质瘤部位,起到杀伤肿瘤的作用。目前,研究最为广泛的是西仑吉肽( cilengitide) ,即序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸( Arg-Gly-Asp,R) 组成,存在于多种细胞外基质中,可与11 种整合素性结合,能有效地促进细胞对生物材料黏附的一种五肽。西仑吉肽原本应用于胰腺癌及黑素瘤的治疗,但疗效不佳,意外发现其对脑胶质瘤的治疗具有非常重要的意义,且目前进行的Ⅱ期临床试验结果也非常喜人,因此,有不少相关研究单独或联合用药,或以R 为药物递送系统的靶向头基,连接在抗肿瘤药物递送系统中,以达到靶向治疗脑胶质瘤的作用。有研究采用环状R( cR) 修饰的PEG-聚乳酸为胶束材料包载紫杉醇,靶向胶束抗胶质瘤细胞的能力提高了2. 5 倍,存活结果也显示了其高效的胶质瘤靶向能力。亦有报道将cR 通过共价连接修饰在脂质体膜表面来增加其细胞摄取。当然,也有利用R 作为胶质瘤成像系统靶头的相关研究,如在cR 赖氨酸残基连接4-18 F-苯甲酸构建示踪剂FB-R,采用microPET 成像技术观察探针在荷U87 MG 皮下瘤胶质瘤模型小鼠上成像效果,30min 时的肿瘤肌肉信号比达到5; 在荷U251 T 原位胶质瘤模型小鼠上同样得到高信噪比的图像,而在正常脑组织几乎没有FB-R 摄取,因此可以有效对整合素αvβ3 阳性的脑胶质瘤进行诊断。也有在三氧化二铁纳米粒表面修饰R 构建磁共振造影剂IONP-R,可以实时监测药物治疗的疗效。

  其他越来越多的研究表明,许多水解酶类如肽酶类、酯酶类、蛋白酶类均与恶性肿瘤的发生发展以及转移等特性相关。而在这些酶类中,可以用于设计脑胶质瘤药物递送系统的则是肽酶类中的氨肽酶,又称CD13、微粒体氨肽酶、氨肽酶M、丙氨酸氨肽酶、p146、p161 以及gp150 等。氨肽酶是一种Zn2 + 依赖的存在于细胞膜上的水解酶,包含967 个氨基酸,由一个短的N 端胞浆域、单跨膜域及包含了活性位点的细胞外功能域构成,能够优先降解具有N-中性氨基酸末端的蛋白质及多肽。这种酶广泛存在于哺乳动物细胞表面,却与恶性肿瘤的、转移、分化、增殖、凋亡和血管生成等都有极大的相关性。针对氨肽酶的分布特点以及其与肿瘤的相关性,目前已设计了一些能够性识别此位点从而用于脑胶质瘤靶向药物递送系统的配体靶头,研究较为广泛的则是天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸( Asn-Gly-Arg,NGR) 多肽序列。此多肽序列能够严格靶向肿瘤新生血管内皮细胞,而非正常脉管组织,因此,也有人以此多肽为配体头基治疗脑胶质瘤,Zhao 等选用NGR 作为靶向脑胶质瘤血管的功能,介导包载紫杉醇( paclitaxel,PTX) 的PEG-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺胶束靶向肿瘤血管,通过切断肿瘤血供来杀伤肿瘤细胞。体外细胞摄取结果显示NGR 修饰后的胶束摄取比未修饰组提高了2. 2 倍。IL-13 是T 细胞衍生细胞因子,在人体内具有广泛的生理作用,尤其参与了炎性反应以及免疫反应。IL-13 受体( IL-13R) 复合物由亲和力相对较低的IL-13Rα1 受体和亲和力相对较高的IL-13Rα2受体构成。相较于IL-13Rα1, IL-13Rα2 更适合用于药物递送的靶标,因为IL-13Rα2 通常不参与信号传递,且高表达于多形性脑胶质瘤细胞。因此, IL-13Rα2 的配体也可作为药物递送系统的头基,治疗脑胶质瘤。有研究采用IL-13 修饰纳米载体包载多柔比星,用于多形性脑胶质瘤的靶向治疗。结果显示,靶向脂质体能够性结合于胶质瘤细胞U87 和U251,而体正常组织细胞; 相较于游离药物组,靶向组能够使多柔比星在肿瘤细胞的蓄积增加并延长药物作用时间,从而产生更高的细胞毒性; 体内结果也显示,靶向组能够更好地颅内肿瘤组织的生长。适配体( aptamer) 是一系列短DNA 或RNA 序列,能够通过三维结构的对接地识别一些靶向蛋白,由于其具有稳定性较高、生产工艺简单、无免疫原性等特点,因此可用作药物递送系统的头基,实现靶向药物递送。AS1411 是一种富含鸟嘌呤的DNA 适配体,能够与肿瘤细胞质膜表面高表达的核仁蛋白( nuleolin) 结合,有报道采用AS1411 修饰纳米粒,显著提高了化疗药物的抗肿瘤效果。因此,适配体也可作为一种头基,实现靶向药物递释。总的说来,根据脑胶质瘤的病理特点,针对肿瘤组织上存在的靶标,可设计相应的药物递送系统,治疗脑胶质瘤,将这种依赖于单一的配体-受体靶向过程称之为一级靶向。胶质瘤一级靶向的过程首先是药物递送系统通过EPR 效应富集于肿瘤细胞,然后依赖配体介导的内吞作用进入肿瘤细胞,从而发挥药效。但是胶质瘤由于其浸润性生长特点,肿瘤边界不明确,某些肿瘤细胞依然被BBB 包围;此外,在胶质瘤发展早期也存在BBB,因此单一靶向策略并不适合早期胶质瘤的治疗,并且对于浸润的肿瘤细胞不能有效地清除,需要更严谨的设计策略来克服一级靶向不能解决的问题。

  为了使得化疗药物能够更好地杀伤脑胶质瘤细胞,需要构建既能靶向肿瘤组织,同时也能穿越BBB 的药物递送系统,通常,将这种双重靶向功能称之为二级靶向。目前对于二级靶向的研究已开始逐渐成为热门,相关的研究方向主要包括两个方面:一是将具有BBB 靶向功能的蛋白或多肽作为第一级靶向功能,将一些已经成功应用于一级靶向的具有肿瘤细胞高亲和力的配体作为第二级靶向功能来构建药物递送系统,这样,一方面可以通过EPR 效应进入脑胶质瘤,另一方面可以通过脑靶向功能介导的跨BBB 和肿瘤高亲和力配体介导的内吞作用进入脑胶质瘤; 另外,有研究报道某些受体同时在BBB 和脑胶质瘤上均存在高表达,因此可利用一个靶向功能同时实现双重靶向,即双靶向( 也是二级靶向的一种) 。目前研究较多的二级靶向药物递送系统包括如下几种。

  二级靶向配体为了实现既能穿越BBB 又能靶向至脑胶质瘤细胞的目的,可同时采用两种靶向配体修饰药物递送系统,以达到双重目的。脑胶质瘤靶向配体如前所述( 一级靶向部分) ,以下介绍一些研究较为热门的BBB 靶向配体。绝大多数营养类代谢底物如氨基酸、葡萄糖等均能通过的载体介导的转运体系通过BBB,这些转运体系同时在脑内侧及脑血管侧均有表达,通常横贯于BBB。最近研究显示,利用这种生理特性,一类结构上同促立体葡萄糖转运体相似的家族———GLUT 家族可以作为BBB 靶向头基的受体。其中,GLUT1 亚型在脑毛细血管及其脉络丛中的表达尤其高,因此,该转运体能够介导与葡萄糖结构类似的化合物穿过BBB,通常,这些结构类似的化合物包括2-去氧葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖类似物等。而从药物递送系统设计的角度考虑,选用甘露糖作为修饰物的复合物居多,其中,对-氨苄基-α-D-甘露糖-吡喃糖苷由于其较高的性及亲和力,应用最为广泛。靶向配体是药物递送系统中的决定性因素,很多内源性配体由于其免疫原性及竞争性在使用时较为受限,因此,外源性配体引发了极大的关注。通常可采用噬菌体展示技术来表达外源性配体,噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达,同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。针对BBB 的特点,通过使用该技术在小鼠体内进行4 个循环的筛选,可得到由12 个氨基酸组成的短肽,即TGNYKALHPHNG( 缩写为TGN) 。作为一种新型配体头基,该多肽并未广泛使用,到目前为止,仅有一篇关于使用TNG 修饰纳米粒,进而证明其具有非常强的BBB 穿透能力的报道。

  双靶向配体除了采用不同的配体靶头修饰药物递送系统外,目前,一些具有血脑屏障及脑胶质瘤双靶向的配体靶头也可用于药物递送系统的设计,这样的设计,通常使得处方的制备更加简单易行。转铁蛋白( transferrin,Tf) 是一类用于转运高铁离子的血浆糖蛋白,相对质量为8 × 104。人体中,肝是产生Tf 的主要场所,而其他部位包括脑组织也一定程度的提供Tf。转铁蛋白能够与细胞膜表面的Tf 受体( transferrin receptor,TfR) 相结合,携带Tf 进入细胞从而维持铁离子的稳态。正常组织以及脑胶质瘤组织中Tf 受体均有表达,且肿瘤组织中的表达明显高于正常组织; 另外,与其他正常组织不同,脑毛细血管内皮上也存在该受体的高表达。因此,可利用Tf 修饰药物递送系统,从而将药物靶向至脑胶质瘤部位,再通过受体介导的胞吞作用,将药物递送至细胞内,从而起到杀伤肿瘤的作用。如 上所述,受体介导的胞吞作用是药物跨越BBB 的机制之一。在脑毛细血管侧,存在大量的受体,包括转运受体、胰岛素受体、内皮生长因子受体以及低密度脂蛋白受体等。其中,低密度脂蛋白受体家族在BBB 上存在高表达,并可介导一系列具有该受体的配体结构的物质通过胞吞作用跨越BBB,如乳铁蛋白、黑素转铁蛋白、受体相关蛋白等。同时,低密度脂蛋白在脑胶质瘤细胞上也存在高表达。也就是说,低密度脂蛋白也可作为药物递送系统的靶点,使得药物跨越BBB 的同时,杀伤肿瘤细胞。Angiopep-2 ( TFFYGGSRGKRNNFKTEEY,2. 4 × 103 ) 作为一种低密度脂蛋白的配体,具有较高的脑穿透能力,是目前研究较为热门的双靶向头基,通常采用该短肽来修饰药物递送系统,已达到上述双重作用。麦胚凝集素( wheat germ agglutinin,WGA) 作为一种外源性凝集素,由于其高脑血管内皮细胞亲和力以及低毒性被认为是能够靶向并穿越BBB 的一类新型药物递送系统靶向头基。有报道表明,其能够协助病毒HIV-1( gp120) 通过BBB 而不其结构功能。另外,由于脑胶质瘤细胞具有高外源凝集素凝集的现象,WGA 能够同时靶向脑胶质瘤细胞,且相比于其他外源凝集素类,WGA 的富集能力更强。因此,可将WGA 作为BBB 及脑胶质瘤细胞的双靶向头基,设计药物递送系统 。上述二级靶向配体头基均已应用于药物递送系统的设计,利用不同的特性,达到治疗脑胶质瘤的目的。He 等选用Tf 作为BBB 靶向头基,WGA 作为肿瘤靶向头基。作者将Tf 和WAG 单独或同时连接到树状高聚酰胺胺( PAMAM) ,利用其空腔包载多柔比星( doxorubicin,DOX) ,体外跨BBB 单层膜实验结果显示,2 h 后PAMAM-PEG-WGA-Tf-DOX 跨膜量为13. 5%,PAMAMPEG-WGA 为8%,PAMAM-PEG-Tf 为7%,游离DOX 为5%。同时作者又考察了系统跨膜后对C6细胞的杀伤作用,二级靶向组的细胞存活最低。Huang 等选用多肽angiopep-2 作为BBB 和胶质瘤双靶向头基,构建了脑胶质瘤靶向基因递送系统,该系统以PAMAM 作为基因载体,包载治疗基因TRAIL 治疗C6 细胞荷瘤模型鼠,靶向治疗组模型小鼠的中位时间靶向治疗组的2 倍。Xin 等 将angiopep-2 修饰于PEG-聚乙内酯( PCL) 纳米粒,包载PTX,所构建的脑胶质瘤靶向递送系统在体内外均显示良好的效果。采用体外模拟BBB 模型考察了纳米粒跨BBB 的转运效率,孵育24 h 后PTX 组为( 4. 57 ± 0. 85 ) % ,NP-PTX 为( 7. 67 ± 1. 30 ) %,ANG-NP-PTX 为( 13. 29 ±1. 09) %。而加入游离的angiopep-2 之后可以显著靶向纳米粒的跨膜效率。Sun 等选用阳离子脂质体来共同输送pEGFP-hTRAIL 质粒和PTX。脑切片原位末端标记检测发现,angiopep-2 修饰组脂质体可以显著地诱发细胞凋亡; 经4 次给药后,angiopep-2 修饰组脂质体治疗组荷U87 MG 模型小鼠中位存活时间为69. 5 d,优于阳性药治疗组47 d。所构建的双靶向共递药脂质体具有显著地抗胶质瘤活性。也有学者将外胚凝集素作为双靶向头基,同时利用他莫昔芬( 选择性雌激素受体调节剂,用于治疗乳腺癌,对于耐药蛋白具有较强的作用) 修饰脂质体,包裹依托泊苷,用以治疗脑胶质瘤。体内外研究结果显示,该靶向系统在C6 细胞中有明显的富集,且能够通过BBB 而靶向肿瘤细胞,肿瘤细胞的药物外排蛋白功能,从而起到杀伤肿瘤的作用。虽然临床前实验结果显示了二级靶向的优越性,但是这类递送系统也存在一定的不足,如系统的合成制备相对来说比较复杂,可控性差,可能会其在体内的应用以及向临床的; 另外,在靶向至BBB 的同时,也会一定程度脑内的稳态,引发一些药物安全性的隐患,可产生一定的不良反应甚至毒性。因此,这类药物真正应用于临床还需更加谨慎的考察和设计。

  BBB 的存在、脑胶质瘤脉管系统的低穿透性以及大脑组织的生理重要性一定程度上了脑胶质瘤的有效治疗。但随着对脑胶质瘤发生发展及其机制的深入认识,根据其特有的生理、病理特点合理已设计出了一系列具有较好疗效的脑靶向药物递送系统,这些新型的纳米制剂靶点不同、运用的原理不同,但却均具有较好的体内外杀伤肿瘤效果。虽然已有的脑靶向药物递送系统具有较多的优势,却也存在着一些问题,大多数化疗药物对肿瘤细胞杀伤的同时,也会引起正常细胞的死亡,因此在构建药物递送系统的时候,除了增加肿瘤部位的蓄积外,另外一个目标是降低在非靶向部位的蓄积,从而降低化疗药物所产生的毒副作用。目前,对于递送系统所应用的靶向功能,其相应的受体或转运体在正常组织亦有少量表达,为了降低递送系统在正常组织的蓄积,当其进入体循环后,靶向功能的靶向作用首先被屏蔽,不发挥寻靶作用,当通过EPR 效应进入肿瘤组织后,响应肿瘤微靶向功能,进而发挥靶向作用。众所周知,由于缺乏有氧呼吸,且糖酵解现象严重,通常肿瘤组织微的pH 介于6. 5 ~ 7. 0,利用这种微酸性,可设计性的药物靶向系统。当在体循环中时,由于处于中性,纳米制剂的靶头( 如穿膜肽TAT 等) ,收缩在内核,不发挥寻靶作用,一旦改变,靶头立即伸出,靶向肿瘤细胞,而使得药物进入肿瘤组织。通常,这种靶头弹出的过程可根据不同的需要而设计,如多聚组氨酸链,在体循环的中性下不带电; 而在微酸中,pH 小于其等电点,导致其带正电,进而具有亲水性,靶头便随着外部的改变而弹出,靶向肿瘤细胞。另外,由于肿瘤组织的生理特殊性,通常存在一些异常表达的酶类,利用这些酶的催化功能,也可设计一些酶的药物靶向系统。马蹄形穿膜肽就是典型一例,由多聚阳离子组成的穿膜肽具正电性,可作为马蹄结构的一条支链; 而由多聚阴离子组成的如多聚精氨酸具负电性,作为马蹄结构的另一条支链; 同时,采用具有酶( 如MMP-2) 特性的半环形多肽作为两条支链的连接臂。由于两条支链分别带有正、负电性,存在相互吸引的作用,且有半环形多肽将其连接,可在体循环中形成一个屏蔽的马蹄形结构,不发挥靶向作用。当循环至肿瘤组织处,由于半环形多肽具有MMP-2 酶性,该连接点被切断,正、负电荷相吸的平衡被,导致穿膜肽,载药的穿膜肽随即快速进入肿瘤组织,进而发挥药效。虽然的药物靶向系统还未应用于脑组织肿瘤的治疗中,但这必将是抗肿瘤靶向药物递送系统设计的一大趋势,尤其是由于脑组织的生理重要性,这种能够尽可能避免毒副作用的设计将更具前景。总之,随着对肿瘤的不断认知以及新技术的不断发展,更具临床意义的新型脑胶质瘤靶向药物递送系统将被不断开发,对脑胶质瘤的治疗起到巨大的推动作用。返回搜狐,查看更多

2017-10-09 01:57

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